Дегидротермический кросслинкинг материала «Корнеопласт»: возможности управления физическими, структурными и биологическими свойствами. Экспериментальное исследование

Кросслинкинг коллагена – образование поперечных сшивок между полипептидными цепями – снижает способность последнего к гидратации. Это свойство является универсальным для любого варианта кросслинкинга (химического, физического, физико-химического) и для любой формы коллагена (желатин, фибриллярный коллаген). Дегидротермический кросслинкинг (ДТК) – это образование поперечных сшивок в биоматериалах при их нагревании под вакуумом. Несмотря на то что методы ДТК широко распространены в тканевой инженерии, его влияние на свойства стромы роговицы практически не изуче ны. Описано применение ДТК при температурах вплоть до 200 °C. Для стромы роговицы температурные пределы ДТК-обработки, допускающие ее трансплантацию, неизвестны.

Цель: оценить влияние дегидротермического кросслинкинга стромальных роговичных трансплантатов на основе материала «Корнеопласт» при температурах 60, 100, 140, 180 и 220 °C на их физические, структурные и биологические свойства.

Материалы и методы. Из глаза свиньи (<12 ч после смерти) иссекали корнеосклеральный диск, из которого удаляли эпителий и десцеметову мембрану, высушивали и высекали 10 мм центральный роговичный графт. Материал известен под коммерческим названием «Корнеопласт» (далее – графт), производится компанией «Трансконтакт» (Москва). Сухие графты (n = 36) были разделены на 6 групп по 6 образцов: в пяти группах их выдерживали в вакууме в течение 3 суток при 60, 100, 140, 180, 220 °C соответственно; 6-я группа – необработанный контроль. Структуру оценивали по данным малоуглового рентгеновского рассеяния и атомно-силовой микроскопии. Для других исследований графты погружали в фосфатно-солевой буфер на 24 часа. Оценивали следующие параметры: внешний вид, качество изображения с расстояния 5 м, светопропускание, влагосодержание, центральную толщину, нагрузку разрыва швом. Тест на эпителизацию проводили ex vivo в органной культуре свежей роговицы свиньи при культивировании в течение 3 суток. Способность к интеграции оценивали в эксперименте in vivo.

 Результаты. Режим 220 °C вызывал обугливающее разрушение материала. Графты после 180 °C стали значительно слабее, чем нейлоновая нить 9-0. В диапазоне 60–140 °C нагрузка разрыва швом значительно снизилась с 913 (контроль) до 137 г (140 °C). Дегидротермическая обработка увеличила светопропускание графтов с 30 (контроль) до 75 % (140 °C), толщина в центре уменьшилась с 3000 (контроль) до 320 мкм (140 °C), влагосодержание упало с 94 (контроль) до 44 % (140 °C). Субъективное качество изображения графтов после обработки при 60, 100 и 140 °C повышалось, и графты позволяли различать оптотипы 0,3, 1,0 и 1,0 децимальной таблицы для проверки зрения соответственно. В органной культуре контрольные графты и графты после обработки при 60 и 100 °C были покрыты клетками эпителия. Поверхность образцов после 140-градусной обработки оставалась гладкой, без клеток. При температуре обработки графтов выше 100 °C терялась их способность к интеграции с тканями реципиента.

Заключение. Определены пределы ДТК-обработки. Изменение температурного режима ДТК позволяет управлять основными свойствами «Корнеопласта» в широком диапазоне для достижения возможности применять его в качестве кератопластического материала.

1. Yannas I.V., Tobolsky A.V. Cross-linking of gelatine by dehydration. Nature. 1967;215(5100):509–510. https://doi.org/10.1038/215509b0

2. Gorham S.D., Light N.D., Diamond A.M. et al. Effect of chemical modifications on the susceptibility of collagen to proteolysis. II. Dehydrothermal crosslinking. Int J Biol Macromol. 1992;14(3):129–138. https://doi.org/10.3390/ma13020377

3. Haugh M.G., Jaasma M.J., O’Brien F.J. The effect of dehydrothermal treatment on the mechanical and structural properties of collagen-GAG scaffolds. J Biomed Mater Res – Part A. 2009;89(2):363–369. https://doi.org/10.1002/jbm.a.31955

4. Chen X., Zhou L., Xu H. et al. Effect of the application of a dehydrothermal treatment on the structure and the mechanical properties of collagen film. Materials (Basel). 2020;13(2). https://doi.org/10.1002/jbm.a.31955

5. Aakre B.M., Doughty M.J. In vitro hydration kinetics of recent post-mortem tissue versus pre-dried corneal stromal tissue. Exp Eye Res. 1997;65(1):127–133. https://doi.org/10.1006/exer.1997.0322

6. Popov I., Anisimov S. Dry physical crosslinking of porcine corneal grafts. In vitro study. Acta Ophthalmol. 2022;100(S267). https://doi.org/10.1111/j.1755-3768.2022.049

7. Hu Y., Liu L., Dan W., Dan N., Gu Z., Yu X. Synergistic effect of carbodiimide and dehydrothermal crosslinking on acellular dermal matrix. Int J Biol Macromol. 2013;55:221–230. https://doi.org/10.1016/j.ijbiomac.2013.01.009

8. Mohd Sobri S.N., Abdul Sani S.F., Sabtu S.N. et al. Structural studies of epithelial mesenchymal transition breast tissues. Sci Rep. 2020;10(1):1–16. https://doi.org/10.1038/s41598-020-58932-5

9. Terzi A., Storelli E., Bettini S. et al. Effects of processing on structural, mechanical and biological properties of collagen-based substrates for regenerative medicine. Sci Rep. 2018;8(1):1–13. https://doi.org/10.1038/s41598-018-19786-0

10. Sibillano T., Terzi A., De Caro L., Ladisa M., Altamura D., Moliterni A. et al. Wide-angle X-Ray scattering to study the atomic structure of polymeric fibers. Crystals. 2020;10(4):274. https://doi.org/10.3390/cryst10040274

11. Giannini C., Terzi A., Fusaro L., Sibillano T., Diaz A., Ramella M. et.al. Scanning X-ray microdiffraction of decellularized pericardium tissue at increasing glucose concentration. J Biophotonics. 2019;12(10):e201900106. https://doi.org/10.1002/jbio.201900106

12. Gültekin O. Computational inelasticity of fibrous biological tissues with a focus on viscoelasticity, damage and rupture. Verlag der Technischen Universität Graz. 2018;34. https://doi.org/10.3217/978-3-85125-655-0