Исследовали материал «Корнеопласт» (далее – графт): разработан по заказу компании ООО «Дубна-Биофарм», производится компанией ООО «Трансконтакт», Москва.

Примененные методики исследования были направлены на изучение следующих свойств графтов:

В качестве исходного материала использовали изолированные свиные глаза в сроки до 12 часов post mortem. Из высушенной роговицы свиного глаза высекали центральный графт диаметром 10 мм. Эти графты (n = 36) делили на 6 групп по 6 образцов. В пяти группах их обрабатывали с помощью ДТК: графты выдерживали под вакуумом на протяжении трех дней при температурах 60, 100, 140, 180 и 220 °C; 6-я группа – необработанный контроль. Далее графты погружали в фосфатно-солевой буфер на 24 ч для гидратации, после проводили ряд тестов.

Для оценки качества изображения графт располагали между двумя предметными гистологическими стеклами в водной иммерсии, после чего с расстояния 5 метров через гидратированный графт фотографировали стандартную децимальную таблицу для проверки зрения.

Объективно светопропускание измеряли при помощи люксметрии: луч непрерывного лазера с длиной волны 532 нм направляли сквозь гидратированный графт в водной иммерсии на датчик промышленного люксметра. Светопропусканием считали отношение зарегистрированной интенсивности излучения после прохождения через графт к фоновому излучению без графта.

Для оценки влагосодержания графт взвешивали на аналитических весах в состоянии полной гидратации, после чего графт высушивали в течение 24 часов и взвешивание повторяли. Для оценки влагосодержания в сухих графтах, полученных при температурах 60, 100 и 140 °C, использовали метод термогравиметрического анализа (ТГА). Измерение проводили на приборе Netzsch TG 209 F1 Libra (Германия). Круглые образцы графтов диаметром 4 мм и массой от 2,6 до 3,1 мг помещали в термостойкую емкость и нагревали от 20 до 1100 °C со скоростью нагрева 20 °C/мин в атмосфере азота.

Центральную толщину измеряли ультразвуковым кератопахиметром в центральной зоне графта.

Для оценки прочности на прорезывание хирургических швов прошивали стальной проволокой в двух точках центральной зоны, формируя замкнутые проволочные кольца. Прошитый таким образом графт подвешивали за одно кольцо, а к другому подвешивали грузы возрастающей массы, начиная с 10 г и усиливая нагрузку, с шагом по 10 г, до полного разрыва графта.

Для оценки структурных изменений в коллагене графтов при температурах ДТК 60, 100 и 140 °C проведены измерения малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР) сухих образцов на спектрометре Xeuss 3.0 (Xenocs, Гренобль, Франция) в лаборатории нейтронной физики Объединенного института ядерных исследований (Дубна, Россия), работающем в точечной геометрии с использованием микрофокусного рентгеновского генератора GeniX3D с излучением Cu-Kα1 (λ = 0,154 нм). Рассеяние от образцов фиксировали детектором Eiger2 R 1M. Измерения проводили в вакууме при комнатной температуре на расстоянии от образца до детектора 350 и 2200 мм, что позволило измерить интенсивность I (Q) рассеяния рентгеновских лучей в диапазоне переданных импульсов 0,03 < Q < 7 нм-1 (Q = (4 π/λ) sin (θ/2), где λ – длина волны падающего излучения, а θ – угол рассеяния). Для оценки структурной организации полипептидных цепей использовали широкоугольную моду спектрометра Xeuss 3.0. Данные регистрировали на детекторе Eiger2 R 500 К (2θ = 26°). Время измерения во всех случаях составляло 20 мин.

Структуру поверхности материала графта оценивали по данным атомно-силовой микроскопии (АСМ). Измерения топографии поверхности образца проводили в полуконтактном режиме с использованием зонда NSG01 на атомно-силовом микроскопе NTEGRA Prima (NT-MDT Spectrum Instruments, Зеленоград, Россия). Обработку изображений осуществляли в программе Image Analysis P9, версия 3.5 (NT-MDT Spectrum Instruments).

Тест на эпителизацию проводили с использованием органной культуры ex vivo. Из свежего свиного глаза (до 6 часов post mortem) в стерильных условиях выкраивали склерально-роговичное кольцо, в центре которого формировали поверхностный кератэктомический дефект глубиной около 200 мкм и диаметром 8,0 мм. На дне дефекта формировали кольцевой интрастромальный карман, в который вставляли графты. Полученную конструкцию культивировали в среде MEM на солях Хэнкса с 5 % телячьей эмбриональной сыворотки, L-глутамином, пенициллином и стрептомицином. Спустя 3 дня культивирования в термостате при 37 °C оценивали эпителизацию передней поверхности графтов без специальных окрасок.

Способность к интеграции с роговицей реципиента оценивали в эксперименте in vivo на 8 лабораторных кроликах. На 4 глазах 4 кроликов была выполнена передняя послойная имплантация графтов, обработанных при 100 и 140 °C (по 2 кролика). В качестве контроля использовали аналогичную по объему кератэктомию и переднюю поверхностную послойную кератопластику необработанной свиной роговицей (по 2 глаза 4 кроликов). Результаты оценивали по данным прижизненной биомикроскопии. Все манипуляции с животными проводили в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 1986).

Операции проводили в условиях ветеринарной микрохирургической операционной с использованием внутривенной премедикации и газового масочного наркоза под операционным микроскопом. Выведение из наркоза осуществляли в условиях дневного ветеринарного стационара.

Субъективное качество изображения и объективное светопропускание возрастают в ряду 60, 100, 140 °C, и через графты удается различить оптотипы, соответствующие остроте зрения 0,3; 1,0 и 1,0 по децимальной шкале соответственно. Графты после обработки в 180 °C приобретают выраженный бурый оттенок: оптотипы 0,9–1,0 различимы, однако светопропускание для 532 нм лазера низкое и сопоставимо с контрольной группой (рис. 1).

При обработке в режиме 220 °C происходит обугливающее разрушение материала. В диапазоне 60–180 °C у графтов возрастают антигидратационные свойства: их влагосодержание по мере увеличения температуры обработки постепенно падает от 94 % в контроле до 39 % в группе 180 °C, что находит отражение в уменьшении центральной толщины от 3300 до 300 мкм соответственно (рис. 2). В температурном диапазоне 60–140 °C прочность на прошивание уменьшается. При 180 °C она достигает критических значений: графты становятся заметно слабее хирургической нити нейлон 9-0, что исключает возможность их использования в хирургии.

Определение содержания влаги методом ТГА показало, что потери массы воды для графтов, сшитых при 60, 100 и 140 °C, составили 4,90; 4,22 и 3,43 % соответственно. В молекулярной структуре графтов, выдержанных при температуре 140 °C, присутствует остаточное количество только связанной воды. В качестве примера можно привести известный факт, что порогом для удаления связанной воды из кварцевых микро- и нанокапиляров является температура 120 °C. Таким образом, можно предположить, что присутствие только связанной воды недостаточно для поддержания биосовместимости графта, что было показано для образцов, обработанных при 140 °C.

Результаты анализа структурных сдвигов в коллагеновых фибриллах стромы роговицы под воздействием ДТК по данным малоуглового МУРР приведены на рис. 3.

Диапазон вектора рассеяния (Q) от 0,4 до ~1,2 нм-1 дает информацию о периоде повторяемости (D = 2πn/Q, n – порядок пика) фибрилл коллагена в аксиальном направлении. Значение D, определенное для n = 9, изменяется на 3 нм: 65 нм для контрольного образца и 62 нм для образца 140 °C. Пики в районе от 1,5 до ~2 нм-1 могут свидетельствовать о наличии триглицеридов [8], основным источником которых в исследуемых образцах, предположительно, являются мембраны клеточных элементов стромы роговицы. Три пика в области широкоугольного рентгеновского рассеяния могут быть охарактеризованы следующим образом: (1) пик в области Q от 3,5 до 8 нм-1 соответствует среднему расстоянию между тройными спиралями в четвертичной структуре (типичное расстояние молекул сухого коллагена составляет 1,1 ± 0,2 нм [9]), которое изменяется от 1,17 нм для контрольного образца до 1,09 нм для образца, подверженного термической обработке при 140 °C; (2) слабый дифракционный пик (Q = 22,02 нм) не изменяется и соответствует расстоянию 0,28 нм между соседними аминокислотными остатками вдоль центральной оси спиральной структуры, что согласуется с данными [9][10] или «alternatively, to one-third of the unit height twist of 0,86 nm» [11]; (3) широкий пик между 8 и 21 нм-1 рассматривается в исследованиях как вклад аморфной фазы [9]. В соответствии с концепцией, предложенной в литературе [10][12], из значений периода повторяемости D можно рассчитать следующие параметры: свободную зону между молекулами коллагена, равную 0,6 D, зону перекрытия 0,4 D и длину молекулы коллагена L = 4,4 D, как схематично представлено на рис. 4. Длина тройной спирали при этом определяется 0,15 D.

Таким образом, укорочение фибрилл вдоль их оси на 3 нм в зоне перекрещивания, возникающее при 140 °C, следует признать уже критическим, приводящим к потере прочности. Следует отметить, что пик в области Q от 3,5 до 8 нм-1 (соответствует среднему расстоянию между тройными спиралями в четвертичной структуре) изменяется существенно как по положению, так и по интенсивности (рис. 3, вставка), что, возможно, связано с термической деградацией полисахаридов. Все это подлежит дальнейшему детальному исследованию, т. к. коррелирует с уменьшением у графтов эластичности, прочности, увеличением гидрофобности, снижением биосовместимости и проницаемости для воды.По данным АСМ структура поверхности после термической обработки от 60 до 140 °C была неизменна и не отличалась от контрольной. Передняя поверхность была более рельефна, а задняя отличалась более выраженной гладкостью (рис. 5).

Результаты исследования биосовместимости показали, что спустя 3 суток органного культивирования на поверхности графтов отмечали краевую эпителизацию в группах «Необработанный контроль», 60 и 100 °C. В группе 140 °C поверхность графтов была гладкой, признаков эпителизации не обнаружено (рис. 6).

Исследование показало, что ДТК стромы роговицы может быть использован для повышения устойчивости графтов к гидратации без критической потери оптических и прочностных свойств. Основное потенциальное преимущество такой обработки состоит в том, что материал, обладающий устойчивостью к отеку, может быть использован в передней кератопластике при сверхнизкой плотности эндотелиальных клеток. В современной хирургии роговицы материалы с подобными свойствами пока не используются.

Обработка графтов при 220 °C приводит к пиролитическому разрушению, 180 °C – значимо снижает прочность на разрыв, 140 °C – значимо снижает эпителизацию материала. Таким образом, к кератопластике могут быть пригодны графты на основе стромы роговицы, обработанные при температурах от 100 °C и ниже.

Передняя послойная кератопластика выполнялась графтами, обработанными при 100 и 140 °C, как показавшими наилучшие физические качества. В сравнении с контролем результаты представлены на рис. 7.

Графт, обработанный при 100 °C, показал способность к эпителизации в раннем послеоперационном периоде и способность к интеграции с роговицей реципиента в отдаленном периоде. Графт, обработанный при 140 °C, несмотря на способность к сохранению прозрачности, не интегрируется с роговицей реципиента, отторгается из-за постепенного прорезывания швов. В результате строма роговицы регенерирует по типу происходящего в первом контроле. Отек периферии роговицы реципиента при имплантации материла после ДТК при 140 °C свидетельствует о блокировании естественного ортогонального тока жидкости через роговицу. Это открывает перспективы для создания на его основе инлаев для лечения эндотелиально-эпителиальной декомпенсации роговицы.

В диапазоне от 60 до 140 °C возрастают антигидратационные и оптические свойства графтов. Графты, обработанные в режиме 220 °C, подвергаются обугливающему пиролитическому разрушению. Графты, обработанные в режиме 180 °C, не проходят тест на разрыв швом и не могут быть использованы в роговичной хирургии. Графты, обработанные в режиме 140 °C, обладают лучшими оптическими свойствами, но не проходят тест на эпителиальную биосовместимость. Физические и биологические свойства коррелируют с наноструктурными изменениями, вызванными ДТК. «Корнеопласт», обработанный в режимах 100 °C и ниже, сохраняет биоинтегративные свойства. Изменение температурного режима ДТК позволяет управлять основными свойствами «Корнеопласта» в широком диапазоне для достижения возможности применять их в качестве кератопластического материала.

Вклад авторов:

Концепция и дизайн исследования: С. И. Анисимов.

Сбор и статистическая обработка материала: Ю. Е. Горшкова, И. И. Виноградов, И. А. Попов, А. Н. Нечаев, Н. С. Анисимова, С.В. Позябин, М.Н. Орлова, А.Г. Шилкин.

Анализ и интерпретация данных, написание текста: С. И. Анисимов, Н. С. Анисимова, И. А. Попов, Ю. Е. Горшкова, И. И. Виноградов, А. Н. Нечаев, С.В. Позябин, М.Н. Орлова, А.Г. Шилкин.

Финальное редактирование: С. И. Анисимов, Н. С. Анисимова, Ю. Е. Горшкова, И. И. Виноградов, А. Н. Нечаев, С.В. Позябин, М.Н. Орлова, А.Г. Шилкин.

Authors’ contributions:

Research concept and design: S.I. Anisimov.

Data collection and statistical processing: Yu.E. Gorshkova, I.I. Vinogradov, I.A. Popov, A.N. Nechaev, N.S. Anisimova, S.V. Pozyabin, M.N. Orlova, A.G. Shilkin.

Data analysis and interpretation, text writing: S.I. Anisimov, N.S. Anisimova, I.A. Popov, Yu.E. Gorshkova, I.I. Vinogradov, A.N. Nechaev, S.V. Pozyabin, M.N. Orlova, A.G. Shilkin.

Final editing: S.I. Anisimov, N.S. Anisimova, Yu.E. Gorshkova, I.I. Vinogradov, A.N. Nechaev, S.V. Pozyabin, M.N. Orlova, A.G. Shilkin.