В связи с увеличением продолжительности жизни и общим старением населения макулопатия, в частности возрастная макулярная дегенерация (ВМД), является одной из ведущих причин необратимой потери центрального зрения, поражающей людей, как правило, пожилого и старческого возраста [1]. Интенсивный рост числа больных, страдающих данным заболеванием, а также недостаток эффективных методов лечения и профилактических мер являются серьезной проблемой здравоохранения со значительными социально-экономическими последствиями для страны [2]. Следует отметить, что ВМД является многофакторным заболеванием, возникающим в результате сложного и не до конца изученного взаимодействия экологических и генетических факторов [3][4]. Вследствие этого многими учеными активно ведутся исследования по изучению причин и механизмов развития ВМД, что в последующем, возможно, станет ключом к созданию действенной терапии [5][6]. С этой целью был разработан целый ряд экспериментальных моделей ВМД на животных, с помощью которых можно воссоздать некоторые ключевые особенности гистопатологических, биохимических и патофизиологических изменений и дать новое представление о лежащих в ее основе механизмах развития. На сегодняшний день подобные модели уже помогли прояснить роль окислительного стресса, воспаления, нарушения углеводного и липидного обмена в патогенезе ВМД, а также стали основой при разработке новых терапевтических средств [7][8]. Несмотря на то что гистологическое строение сетчатки и сосудистой оболочки экспериментальных моделей отличается от строения данных структур человека, каждая из них имеет свое значение в научных исследованиях.

Проанализировать данные литературы, посвященные выбору экспериментальной модели ВМД и методов ее моделирования при изучении патогенеза и способов лечения данной офтальмопатологии.

Проведен анализ публикаций на ресурсах PubMed, eLibrary, Cyberleninka. В данной обзорной статье будет рассмотрен ряд животных, используемых в качестве моделей ВМД, методы моделирования ВМД и проведена их сравнительная оценка.

1. Выбор экспериментальной модели. Согласно обзору литературы, существует большое количество экспериментальных моделей, используемых для изучения механизмов развития и способов лечения ВМД [9][10]. В качестве модельных объектов чаще всего используются такие животные, как мыши, крысы, кролики, свиньи и приматы (табл. 1) [11][12].

Следует отметить, что, несмотря на большое разнообразие существующих моделей, ни одна из них полностью не отражает все особенности развития ВМД у человека. Это связано, в первую очередь, со сложностью воспроизведения данного заболевания, так как в патогенез ВМД вовлечен ряд генетических и экологических факторов, как упоминалось ранее [13][14]. Второй немаловажной проблемой, которая усложняет использование животных в качестве модели ВМД, является наличие анатомических различий в строении сетчатки глаза используемых моделей и человека [15][16]. Однако, даже несмотря на это, существующие модели стали неотъемлемой частью для понимания патофизиологии ВМД, а также создания новых методов лечения [17][18].

Таким образом, важно понимать, что существующие экспериментальные модели не являются идеальными моделями и не могут быть точным этиологическим отражением болезни человека. Каждая представленная в настоящее время модель имеет свои преимущества и недостатки.

Использование мышей в качестве экспериментальной модели ВМД. На протяжении десятилетий грызуны были наиболее предпочтительными моделями для изучения заболеваний сетчатки [19]. Это связано с тем, что использование грызунов имеет множество преимуществ. Во-первых, с временной и экономической точки зрения это относительно быстрый и недорогой способ проведения экспериментов; во-вторых, возможность исследовать геноспецифические механизмы развития ВМД in vivo путем создания трансгенных и нокаутных мышей [20][21]. Например, учеными были созданы мыши с нокдауном генов Sod1 и Sod2 с целью проверки гипотезы о том, что окислительный стресс играет важную роль в патогенезе ВМД. Согласно проведенному американскими учеными исследованию, снижение экспрессии Sod2 было связано с повышенным риском развития ВМД. У таких животных отмечалось повышенное образование активных форм кислорода (АФК), наблюдались гистологические изменения в пигментном эпителии сетчатки (ПЭС), фиксировалось значительное истончение внутреннего слоя сетчатки и слоя фоторецепторов, что в дальнейшем приводило к нарушению нормального функционирования сетчатки [5][22].

Стоит отметить, что сетчатка у мышей лишена макулы и фовеа, но анатомически у них есть ключевые структуры сетчатки – ПЭС, мембрана Бруха и хориокапилляры, которые поражаются при ВМД человека. Однако при развитии ВМД отложения образуются над ПЭС, а не под ним, и их состав несколько отличается от состава друз человека [16][23]. Подобные факты ограничивает полезность использования данной модели. Также важно отметить, что ни одна модель мыши не воспроизводит полностью всю патофизиологию ВМД. Данные модели как таковые служат системами для конкретных биологических процессов. Кроме того, существуют некоторые ограничения в использовании моделей с нокаутом генов, одни из которых связаны со сложностью контроля тяжести течения заболевания [24].

Использование крыс в качестве экспериментальной модели ВМД. Крысиный глаз имеет сходную структуру сетчатки с глазом мыши, за исключением того что имеет более крупный размер [25]. В последние годы в качестве модели ВМД используются крысы линии OXYS [17]. Первоначально крысы OXYS были выведены из крыс линии Wistar в качестве модели предрасположенности к катаракте [26]. Однако ученые показали, что у крыс OXYS спонтанно развивается ретинопатия к 3-месячному возрасту, которая сопровождается ультраструктурными изменениями сетчатки, включая, например, утолщение мембраны Бруха. Было показано, что подобные изменения связаны с дисбалансом иммунных и воспалительных реакций. Подобные нарушения возникают на фоне старения организма, изменяется профиль экспрессии многочисленных генов в сетчатке [27].

Поскольку у крыс, как и у мышей, отсутствует макула, к результатам подобных исследований ВМД следует относиться с осторожностью, прежде чем использовать полученные данные в клинике.

Использование кроликов в качестве экспериментальной модели ВМД. Экспериментальные исследования различных видов офтальмопатологий наиболее часто выполняются на глазах кроликов ввиду удобства работы: это сходные с глазом человека размеры глазного яблока, что позволяет, например, проводить субретинальные инъекции и векторы для генной терапии; возможность клинического наблюдения без дополнительного специализированного оборудования; относительно недорогое содержание животных [28][29]. Однако строение сетчатки кролика имеет отличия от сетчатки человека: это мерангиотический тип сетчатки, отсутствие макулярной области, иное распределение фоторецепторов [30]. Так, сосудистый рисунок сетчатки кролика характеризуется наличием кровеносных сосудов в ограниченной части сетчатки. Крупные сосуды располагаются на внутренней поверхности сетчатки и образуют поверхностные, глубокие и периферические капилляры, остальная сетчатка практически бессосудистая. У кроликов центральная зона сетчатки не содержит желтый пигмент и фовеа, однако она представлена полосой повышенной остроты зрения – зрительной полоской. Здесь также отмечается высокая плотность фоторецепторов (атипичные колбочки) и плотность ганглионарных клеток (3–4 слоя), что соответствует общей структуре сетчатки млекопитающих в зонах наибольшей остроты зрения [31]. Учитывая вышеизложенное, можно полагать, что гомологичные структуры глаз человека и кролика, обеспечивающие наивысшую остроту зрения и образованные одними и теми же гистологическими элементами, при воздействии различных факторов характеризуются стереотипным комплексом патоморфологических реакций, отражающих один и тот же патогенетический путь утраты функциональных возможностей центральной зоны сетчатки. В связи с этим мы можем говорить о возможности экстраполяции получаемых в эксперименте данных на человека.

Ряд авторов отмечает превосходство использования кроликов в качестве модели хориоидальной неоваскуляризации [32]. Следует отметить, в основе неоваскулярной формы ВМД лежит хориоидальная неоваскуляризация (ХНВ) [33]. Сообщается, что подобные модели являются высокоэффективными и воспроизводимыми. Так, в исследованиях отмечалась 60–83% вероятность возникновения экспериментальной субретинальной неоваскуляризации у кроликов при ее моделировании различными способами (например, при субретинальной инъекции FGF или инъекции Матригеля). Создаваемые модели являются также стабильными во времени: для сравнения, индуцированная ХНВ у грызунов и приматов обычно длится всего лишь 1 месяц, после чего происходит восстановление гематоретинального барьера, в то время как у кроликов подобное нарушение сохраняется более 9 недель [34]. Следует также отметить патологическое сходство моделируемой ХНВ у кроликов с развитием данной патологии у человека: проявляются признаки воспаления, усиливается пролиферация сосудов, наблюдается проникновение новых сосудов через мембрану Бруха в субретинальное пространство – все это соответствует клиническим признакам патологического ангиогенеза у человека [35]. Также следует отметить, что кролики как объект исследования являются экономически более выгодными по сравнению с использованием в качестве моделей свиней или приматов.

Несмотря на существующие отличия в строении сетчатки кроликов и человека, большое преимущество их использования заключается в том, что такой тип модели может быть полезен для проведения долгосрочных исследований с получением новых представлений о патогенных процессах развития ХНВ, а также использоваться при оценке современных антиангиогенных, противовоспалительных и антипролиферативных терапий лечения [36][37].

Использование свиней в качестве экспериментальной модели ВМД. Среди животных, не относящихся к приматам, глаз свиньи считается наиболее похожим на глаза человека, особенно в отношении размера. Несмотря на то что у данных животных отсутствует фовеа, у них существует зрительная полоса с высокой плотностью колбочек, которая располагается на горизонтальной оси вблизи заднего полюса сетчатки [38][39]. В связи с этим ряд заболеваний сетчатки был изучен с использованием данной модели [40][41].

Хотя использование свиней в качестве моделей ВМД имеет преимущества, главным образом из-за сходства строения сетчатки, данная модель не является идеальной. Это связано с тем, что по сравнению с более мелкими млекопитающими затраты на содержание и разведение таких животных значительно выше.

Использование приматов в качестве экспериментальной модели ВМД. Наиболее очевидным преимуществом использования нечеловеческих приматов (NHPS) в исследованиях, направленных на изучение ВМД, является то, что структура их сетчатки практически идентична человеческой, а самое главное – у них есть истинная макула. Более того, геном приматов рода макак более чем на 90% схож с геномом человека [42]. Таким образом, в связи с анатомическим, физиологическим и генетическим сходством модель NHPS является наиболее идеальной для изучения наследственной дегенерации желтого пятна [43].

Учеными было выявлено, что у макак-резусов и яванских макак проявляются некоторые формы наследственных дегенераций сетчатки, а также сообщалось о спонтанном образовании друзоподобных тел у стареющих животных, что соответствует гистопатологическим особенностями ранней стадии ВМД у человека [11][44]. Однако расходы на использование моделей приматов, нехватка соответствующих средств на содержание, довольно высокая продолжительность проведения экспериментов, а также этические аспекты ограничивают широкое применение подобных моделей.

Таким образом, при сравнении существующих экспериментальных моделей можно сделать следующие выводы.

2. Способы моделирования ВМД у животных. Все способы моделирования патологических процессов, происходящих в сетчатке глаза, можно разделить на две большие группы: генетические способы моделирования и индуцированные (химические и физические) [23].

В данном обзоре мы более подробно рассмотрим группу индуцированных моделей ВМД.

Химически-индуцированные модели ВМД. Модели подобного рода получают путем токсического поражения сетчатки при инъекции различных химических соединений. Инъекции препаратов могут осуществляться внутривенно, субретинально или в полость стекловидного тела глаза животных [45].

А) Введение лабораторным животным йодата натрия (NaIO3). В литературе довольно часто встречается использование данного препарата с целью моделирования ВМД у животных [46][47].

Йодат натрия представляет собой окисляющее соединение, которое индуцирует выработку АФК, что, в свою очередь, способствуют повреждению клеток ПЭС с вторичным воздействием на фоторецепторы и хориокапилляры [48]. В частности, вначале NaIO3 индуцирует некроз в клетках ПЭС, за которым следует атрофия хориокапилляров и дегенерация сетчатки [49][50]. Повреждающее воздействие йодата натрия на сетчатку было продемонстрировано на многих видах млекопитающих, включая овец, кроликов, крыс и мышей, с различными дозами и путями введения. В большинстве исследований использовали относительно высокие дозы NaIO3 (50–100 мг/кг) и сообщали о быстром повреждении ПЭС, характеризующемся дефрагментацией и потерей ядер клеток [51][52]. Это относительно простая и быстро индуцируемая модель, которая может служить полезным инструментом для оценки новых методов лечения дегенераций сетчатки, которые в основном вызваны дисфункцией клеток ПЭС.

Б) Введение лабораторным животным N-метил-N-нитрозомочевины (C2H5N3O2, MNU). Известный канцероген – N-метил-N-нитрозомочевина – также используется на различных моделях животных, включая мышей, крыс, кроликов, для химической индукции дегенерации фоторецепторов [53–55]. Ряд авторов показали, что интравитреальное применение MNU приводит к односторонней дегенерации фоторецепторов у животных [56][57].

В) Введение лабораторным животным хлорида кобальта (CoCl2). Инъекция CoCl2 широко используется в качестве агента, имитирующего гипоксическое/ишемическое состояние. Гипоксия, вызванная химическими агентами, является широко используемой моделью, поскольку возможно контролировать уровень гипоксии, изменяя концентрацию гипоксического агента [58]. Хлорид кобальта способствует образованию АФК, что, в свою очередь, усиливает окислительный стресс, приводящий к гибели клеток [59]. Кроме того, кобальт необходим для синтеза витамина B12, однако избыточное воздействие может привести к токсичности и индуцировать апоптоз [60].

Помимо приведенных препаратов, вводимых животным с целью моделирования повреждения сетчатки, существует целый спектр других агентов: гидрохлорид L-орнитин, монойодуксусная кислота, каиновая кислота, N-метил-D-аспартат, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) и многое другое [45]. Следует отметить, что внутривенное введение подобных веществ оказывает системное токсическое воздействие на организм, приводя не только к двусторонней дегенерации сетчатки, но и к снижению общего состояния здоровья экспериментальных животных. В связи с этим наиболее предпочтительным вариантом является местное введение препаратов, что позволяет избежать нежелательных системных побочных эффектов [61]. В дополнение представленные химические модели легко применяются к мышам и другим животным.

Физически-индуцированные модели ВМД. Данная группа включает механические и световые методы повреждения сетчатки.

А) Механическое повреждение сетчатки. Данный способ моделирования основан на механическом повреждении ПЭС центральной области сетчатки [62]. В одном из исследований было показано, что при нанесении механической травмы у кроликов происходит отслойка сетчатки, формируется модель атрофии хориокапилляров и ПЭС [63]. Однако недостатком данного метода является острое воспаление в ответ на травматическое повреждение, а также сложность дозирования интенсивности воздействия.

Б) Световые методы повреждения сетчатки.

Повреждение сетчатки видимым, некогерентным светом (400–780 нм). Повышенное хроническое воздействие света было идентифицировано как фактор риска развития ВМД [64]. В связи с этим повреждение сетчатки светом хорошо зарекомендовало себя как модель дегенерации in vivo, имитирующая большинство основных характеристик ВМД человека [23][45]. Широкое использование модели светоиндуцированной дегенерации сетчатки для изучения ВМД также связано с тем, что данный метод имеет преимущества: однородная гибель фоторецепторов, возможность в течение довольно короткого времени индуцировать развитие заболевания. Кроме того, данная модель позволяет регулировать степень тяжести повреждения сетчатки путем манипулирования интенсивностью и продолжительностью воздействия света для получения необходимой степени дегенерации. Так, рядом исследователей было обнаружено, что более короткие длины волн, расположенные ближе к синей области электромагнитного спектра, имеют самый высокий риск возникновения дегенерации сетчатки по сравнению с более длинными волнами [65]. На сегодняшний день существует большое разнообразие протоколов по проведению светоиндуцированного повреждения сетчатки в зависимости от интенсивности освещения, времени экспозиции, спектральных характеристик источника света и выбранного объекта [64][66]. Например, в исследованиях американских ученых крыс линии Sprague Dawley подвергали воздействию рассеянного холодного белого флуоресцентного света при 5000 люкс в течение 5 часов, в то время как в другом исследовании мыши линии Balb/c подвергались воздействию 10 000 люкс холодного белого светодиодного света (LED) в течение 4 часов, а пигментированные кролики подвергались воздействию света 18 000 люкс в течение 2 часов [67–69].

Повреждение сетчатки когерентным светом. Учеными было установлено, что лазерное воздействие на сетчатку животных способствует формированию острой ишемии сетчатки, ХНВ и очаговому поражению сетчатки [70][71]. С этой целью применяются различные типы лазеров, излучающих в УФ, видимой и ИК-области спектра, – аргоновые, гелий-неоновые, ксеноновые, диодные и др. [45][72]. Как и при воздействии видимого света, степень повреждения лазером зависит от длительности импульса, мощности, а также времени воздействия. Например, в одном из исследований глаза кроликов подвергали воздействию аргонового лазера (12–16 выстрелов) мощностью 400 мВт, в другом – мощностью 0,8 и 1 Вт [70][73]. В ходе моделирования повреждений лазером преимуществом является возможность регулировать интенсивность воздействия, однако недостатками существующих моделей являются неэффективное прицеливание, необходимость использовать высокий уровень мощности лазера для точного попадания луча, а также опасность попадания в сосуды сетчатки и возникновения кровоизлияний.

Таким образом, при сравнении существующих методов моделирования повреждения сетчатки у животных можно сделать следующие выводы.

3. Способ моделирования возрастной макулярной дегенерации с применением фототоксического эффекта у кроликов.

Подробно изучив проблемы выбора животной модели и способов моделирования, нами была разработана собственная модель возрастной макулярной дегенерации, основанная на комплексном лазер-индуцированном воздействии и фототоксическом повреждении сетчатки у кроликов породы шиншилла (Патент № 2727872). Техническим результатом изобретения явилось снижение послеоперационного воспаления, а также направленность фотоповреждающего воздействия только на сетчатку.

Экспериментальное моделирование различных патологических процессов в органе зрения является неотъемлемой частью как фундаментальных исследований с целью более глубокого понимания механизмов развития заболевания, так и частью прикладных исследований – отработки новых методов консервативного и хирургического лечения. Это определяет важность использования экспериментальных моделей. На этапе постановки своих исследований перед каждым экспериментатором стоит сложная задача выбора адекватной животной модели, имеющей наиболее близкую гомологию с анатомией и патологией человека.

Вклад авторов: авторы внесли равный вклад в работу.

Authors’ contributions: the authors contributed equally to this work.