В работе использовали четыре экспериментальные модели неоваскуляризации глаз: две модели имели заднюю (хориоретинальную) локализацию и две – переднюю (роговичную).

Модель 1 формировали путем имплантации Матригеля (гелеобразная смесь белков, выделяемых саркомой Энгельбрета – Холма – Сварма) экспериментальным животным в субхориоидальное пространство, модифицируя процедуру, описанную Passaniti A. [1][2]. Использовали аликвоты (100 мкл) Матригеля (BD Biosciences), содержащие гепарин 60 у. е./мл и 500 нг/мл VEGF165, приготовленные на льду. Матригель с 500 нг/мл VEGF165 вводили субхориоидально после формирования профильного туннельного «кармана» в склере 15 половозрелым кроликам породы советская шиншилла. Предварительно выполняли надрез склеры (на 5/6 толщины) в ретроэкваториальной части, затем осуществляли ее тоннельное расслоение в сторону заднего полюса. В образовавшийся «карман» вводили Матригель. Вход в тоннель герметично зажимали пинцетом на одну-две минуты, позволяя веществу под влиянием температуры тела полимеризоваться. Матригель быстро преобразовывался в цельный гелеобразный имплантат. Конъюнктивальный разрез не ушивали.

Модель 2 представляла собой классическую субретинальную неоваскулярную мембрану (СНМ), предложенную J. Miller и соавт. (1990). Ее создавали путем повреждения мембраны Бруха лазерным воздействием. Однако вместо приматов использовали кроликов породы шиншилла массой 3,5–4,0 кг. Выполняли лазеркоагуляцию сетчатки излучением длиной волны 577 нм (экспозиция 0,1 сек; диаметр пятна в фокальной плоскости 100 µm; мощность 350 мВт). Коагуляты наносили рядом с диском зрительного нерва [3][4].

Модель 3 неоваскуляризации передней (роговичной) локализации формировали путем нанесения 40-секундной аппликации на апекс роговицы диском хлопчатобумажной ткани диаметром 7 мм, пропитанным 10% раствором NаОН [5].

Модель 4 формировали путем прошивания роговицы кролика викриловыми швами (15 кроликов). Известно, что викриловые нити 6–0/7–0 вызывают воспалительную реакцию, в которой действуют провоспалительные и проангиогенные индукторы неоангиогенеза. Патологический процесс завершался формированием фиброваскулярного комплекса с образованием сосудов в строме роговицы [6–9].

Все модели формировали на глазах одного биологического вида экспериментальных животных – кроликах породы шиншилла (n = 60, 60 глаз). Соответственно моделям кроликов распределяли на четыре группы. В каждой группе пять кроликов (5 глаз) служили контролем, десять животных были опытными (10 глаз).

Клиническая картина и гистологические особенности разных типов неоваскуляризации были изучены и описаны нами ранее [10].

Животных лечили рекомбинантными белками с заявленным ангиостатическим эффектом – эндостатином, тумстатином и PEDF, предоставленными для тестирования ИБХ РАН им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова.

Лечить кроличьи глаза с моделями неоваскуляризации начинали в разные сроки, которые определялись типом модели и фазой неоангиогенеза, а также заявленным потенциалом белка.

Так, на моделях задней (хориоретинальной) локализации к лечению приступали после ангиографической и ОКТ-верификации полноценной активной неоваскулярной мембраны (модель 2, 7–14-е сутки) или офтальмоскопически просматриваемого аномального полипоидального сосуда с зонами сопровождения и диспигментацией (модель 1, 7–14-е сутки). Глаза с моделью 3 неоангиогенеза, вызванного щелочным ожогом, начинали лечить со дня появления сосудов, прорастающих с лимба в роговицу, то есть с 12–14-го дня со дня аппликации 10% раствором NаОН [5]. Глаза с экспериментальной моделью 4 неоангиогенеза, вызванного прошиванием роговицы викриловыми швами, начинали лечить одновременно с прошиванием. Далее ежедневно в течение 10 дней субконъюнктивально вводили антиангиогенные препараты: эндостатин, тумстатин и PEDF.

Пептиды вводили субконъюнктивально в расчетных дозах: 7,2 нг PEDF, 96 нг эндостатина, 70,2 нг тумстатина; инъекции повторяли ежедневно в течение 10 дней. Из эксперимента выводили на 30-й день.

Опытными были левые глаза 10 кроликов. Контролем служили 5 правых глаз с моделью неоангиогенеза, не получившие лечения ангиостатиками. Доказательность базы складывалась из суммации клинических, инструментальных и морфологических показателей.

При работе с экспериментальными животными придерживались международных стандартов (Резолюция ARVO «По использованию животных в экспериментальных исследованиях» 2018 г.).

Ежедневно в течение 14 дней экспериментальным животным с моделями неоангиогенеза передней и задней локализации проводили биомикроскопию/офтальмоскопию. Картину глазного дна фотографировали на фундус-камере. Наряду с фоторегистрацией клинической картины неоангиогенеза проводили ангиографию переднего или заднего отрезка глаза с флюоресцеином, морфологические исследования выполняли в полном объеме. Верификацию неоваскуляризации подтверждали офтальмоскопически и ангиографически, вводя в ушную вену флюоресцеин натрия.

Мониторинг и оценку состояния глаз кроликов (до, в ходе опыта и по завершении эксперимента) осуществляли, используя следующие инструменты и методы визуализации: бинокулярный (налобный) офтальмоскоп непрямого вида Heine, фундус-камеру VISUCAM 500 ZEISS (цветное фотографирование), ручную фундус-камеру Portable Ophthalmic Imager Volk Optical, Inc., которую использовали для фоторегистрации глазного дна в зоне интереса на операционном столе в условиях операционной, фундус-камеру FF 450 ZEISS (флюоресцеиновая ангиография), сканирующий лазерный офтальмоскоп F-10 Nidek (флюоресцеиновая ангиография, аутофлюоресценция).

В экспериментальной офтальмологии часто приходится использовать различные модели неоангиогенеза на глазах экспериментальных животных.

Модели хориоретинальной неоваскуляризации ближе по клиническим проявлениям и механизмам патогенеза природе неоваскулярной возрастной макулодистрофии (ВМД). Однако на них сложнее протестировать лекарственные технологии, проанализировать спектр их биологических эффектов, а также выполнить сравнительную оценку эффективности с уже известными препаратами-аналогами. Они позволяют оценить эффективность ангиостатиков по бинарному принципу: есть терапевтический эффект / нет эффекта. В этом аспекте модели передней локализации предпочтительнее из-за свободного доступа, легкости воспроизведения и хорошей визуализации зоны интереса, позволяющей выполнять мониторинг в ходе лечения, хотя ангиогенез на этих моделях имеет другую природу. Однако только эти модели позволяют провести комплексную оценку патологического процесса с количественным подсчетом новообразованных сосудов в роговице, их длины, диаметра просвета, полноценности сосудистой стенки, паравазального клеточного микроокружения. Вполне очевидно, что именно такая информация отражает терапевтический потенциал ангиостатиков, блокирующих или подавляющих миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток, и их способность к образованию сосудоподобных структур.

В рамках поставленной задачи на этих моделях нами были разработаны несколько количественных клинических и морфологических показателей. Так, в оценке клинической эффективности мы использовали такой параметр, как плотность васкуляризации роговицы, которую сравнивали в опытном и контрольном глазах. Результаты оценивали биомикроскопически по балльной шкале: 0 – отсутствие врастания сосудов в прозрачные слои роговицы; 1 – врастание в роговицу единичных сосудов; 2 – вросшие в роговицу сосуды образуют «венчик», в котором дифференцируются отдельные сосуды; 3 – вросшие сосуды образуют сплошной красный «ореол» в прозрачных участках роговицы.

Наряду с этим мы измеряли площадь помутнения роговицы в зоне неоваскуляризации колориметрическим методом в пикселях, используя программу Photoshop. Выделяли области помутнения роговицы инструментом «Волшебная палочка», затем фиксировали количество пикселей, составляющих выделенную область, появляющееся на рабочей панели компьютера. Найденное значение условно обозначали как «Помутнение». Затем инструментом «Овальная область» аналогичным техническим приемом выделяли роговицу на фотографии кроличьего глаза, высчитывая количество пикселей, составляющих эту область изображения в программе Photoshop; цифра также появлялась на рабочей панели компьютера. Найденное значение обозначали как «Роговица» (рис. 1 а и б). Площадь помутнения роговицы рассчитывали по формуле: П/Р × 100%, где П – это помутнение роговицы в пикселях, Р – это вся роговица в пикселях. Помутнение роговицы в контрольном глазу было тотальным, диффузным, площадь помутнения принималась за 100%.

Мы также рассчитывали площадь неоваскуляризации роговицы в зоне неоангиогенеза, используя все тот же технический прием и программу Photoshop, в которой выделяли заполненные флюоресцеиновым красителем сосуды роговицы на фотографии, и программа автоматически высчитывала в пикселях этот специальный показатель (см. ниже, рис. 2 а, б).

Пример расчета показателей: флюоресцирующая область = 26 190 пикселей;вся роговица = 835 171 пикселей;отношение = 26 190 / 83 5171 = 0,03 или 3%.

Таким образом, площадь неоваскуляризации = 132 мм2 × 0,03 = 3,96 мм2 (132 мм2 площадь роговицы на фото, где красным отмечена граница разделения цветов по колориметрии).

Результат сравнивали с общей площадью роговицы.

Кроме того, для оценки использовали индекс васкуляризации, который определяли как отношение площади роговицы, подвергшейся неоваскуляризации, к общей площади роговицы. Индекс васкуляризации подсчитывали, производя серию снимков среза лимбо-роговичной ткани, проходящей вокруг шва. Затем с помощью программы Photoshop инструментом «Овальная область» выделяли пиксели, составляющие изображение просвета сосудов в срезе, и подсчитывали их количество (рис. 3). После полученную цифру делили на общее количество пикселей изображения. Таким образом получали показатель, именуемый далее как индекс васкуляризации для участка гистологического препарата, фиксированного на снимке. Результаты представляли собой промежуточные индексы васкуляризации. Для конечного индекса васкуляризации всего препарата мы находили среднее арифметическое из всех промежуточных на каждом глазу.

Таким образом, в качестве количественных показателей, отражающих биологическую активность пептидов, нами был разработан и предложен комплекс методов оценки. С их помощью было установлено, что введение рекомбинантных пептидов с предполагаемым ангиостатическим потенциалом одновременно с индукторами ангиогенеза может ингибировать пролиферацию и миграцию эндотелиальных клеток, предотвращать или подавлять формирование капилляроподобных структур на начальном этапе ангиогенеза. Также раскрывалась возможность сравнения амплитуды биологических эффектов на разных моделях ангиогенеза с различными механизмами патогенеза (табл. 1, 2).

Кроме того, мы использовали на этапе сравнительной оценки состав клеток и количество клеток в инфильтрате роговицы вокруг экспериментальных швов на модели 4. Инфильтрат преимущественно состоял из лимфоцитов, плазмоцитов и эозинофилов. Их и подсчитывали под микроскопомпри увеличении ×100 (рис. 4). Результаты сравнительной оценки биологических эффектов пептидов представлены в табл. 2.

В рамках доклинических исследований мы разрабатывали критерии комплексной оценки эффективности рекомбинантных пептидов с заявленным ангиостатическим потенциалом. Для изучения возможных биологических эффектов использовали четыре модели с разными механизмами индукции ангиогенеза роговичной и хориоретинальной локализации.

Благодаря комплексному подходу и нескольким разработанным критериям оценки эффективности была получена ценная и многогранная информация, свидетельствующая о наличии у тестируемых пептидов широкого спектра биологических ангиостатических эффектов, проявляющихся на разных этапах ангиогенеза, начиная от ингибирования сосудистого фактора роста эндотелия (в пользу такого утверждения свидетельствовали сокращение площади отека и исчезновение просачивания сквозь сосудистую стенку на моделях 1–3) до подавления пролиферации и миграции эндотелиальных клеток, прерывания формирования сосудистых каналов (подтверждено индексом васкуляризации, протяженностью сосудов в роговице, колориметрическим показателем васкуляризации, табл. 3). На модели 4 был выявлен провоспалительный эффект пептидов. Его отражали количественные показатели воспалительных клеток в формирующемся фиброваскулярном комплексе (табл. 2). Как известно, провоспалительные молекулы являются очень мощными триггерами неоангиогенеза.

В преддверии клинических испытаний доклинические этапы с использованием нескольких моделей заболевания и нескольких видов экспериментальных животных оправданы и целесообразны. Именно такой подход был одобрен последними российскими регламентирующими документами (Приказ Минздравсоцразвития России от 01.04.2016 № 199н «Об утверждении правил лабораторной практики», Национальный стандарт Российской Федерации (ГОСТ 33044-2014 от 26.01.2015)) [11–12].

Нами были разработаны и апробированы критерии комплексной оценки эффективности антиангиогенных препаратов на четырех моделях неоваскуляризации глаза. С помощью этих критериев была проанализирована сравнительная эффективность препаратов ангиостатической направленности и идентифицированы их противовоспалительные эффекты, потенцирующие ангиостатический потенциал. Обосновано применение моделей неоангиогенеза роговичной локализации для изучения спектра биологической активности ангиостатических препаратов и количественной оценки их эффектов.

Для полноценной оценки эффективности целесообразно использовать комплекс индикаторов, раскрывающих все возможные эффекты на клиническом и морфологическом уровнях.

Вклад авторов: авторы внесли равный вклад в эту работу.Обзор литературы, сбор данных, анализ и интерпретация данных, написание статьи, финальное редактирование: В.Г. Лихванцева, А.С. Геворкян и С.Г. Капкова.А.И. Мирошников и Р.С. Есипов обеспечили исследования ангиостатиками, помогли собрать информацию по препаратам и рассчитать дозу, а также интерпретировали фармакологические эффекты.

Authors’ contributions: authors have contributed equally to this work.Literature review, data collection, data analysis and interpretation, writing an article, final editing: V.G. Likhvantseva, A.S. Gevorgyan and S.G. Kapkova.A.I. Miroshnikov and R.S. Yesipov provided studies of angiostatics, helped to collect information on drugs and calculate the dose, as well as to interpret pharmacological effects.