В работе использовали две модели неоваскуляризации глаз задней (хориоретинальной) локализации и две – передней (роговичной) локализации. Все модели формировали на глазах одного биологического вида экспериментальных животных – кроликах породы советская шиншилла.

Модель № 1 формировали путем имплантации матригеля (гелеобразная смесь белков, выделяемых клетками мышиной саркомы Энгельбрета – Холма – Сварма) экспериментальным животным (15 кроликам) в субхориоидальное пространство, модифицируя процедуру, описанную Passaniti A. [1][2]. Использовали аликвоты (100 мкл) матригеля (BD Biosciences), содержащие гепарин 60 у. е./мл и 500 нг/мл VEGF165, приготовленные на льду. Матригель с 500 нг/мл VEGF165 вводили субхориоидально после формирования профильного туннельного «кармана» в склере правого глаза у 15 половозрелых кроликов породы советская шиншилла. Предварительно выполняли надрез склеры (на 5/6 толщины) в ретроэкваториальной части, затем осуществляли ее туннельное расслоение в сторону заднего полюса. В образовавшийся «карман» вводили подготовленный матригель. Вход в туннель герметично зажимали пинцетом на 1–2 минуты, позволяя веществу под влиянием температуры тела полимеризоваться. Матригель быстро преобразовывался в цельный гелеобразный имплантат. Конъюнктивальный разрез и доступ к туннелю, как и сам туннель, не ушивали. На 7-й день выполняли лазерную деструкцию мембраны Бруха, используя излучение длиной волны 577 нм, диаметр пятна в фокальной плоскости был равен 100 μm, мощность составляла 300 мВт. Наносили 5 коагулятов в 100 мкм от видимой границы аномальных дилатированных сосудов (рис. 1 а и б).

Модель № 2 представляла собой классическую субретинальную неоваскулярную мембрану (СНМ) в эксперименте, предложенную J. Miller и соавт. (1990). Ее создавали путем повреждения мембраны Бруха лазерным воздействием. Для этого 15 кроликам породы советская шиншилла массой 3,5–4,0 кг производили лазеркоагуляцию сетчатки, используя лазерное излучение длиной волны 577 нм. При этом экспозиция была постоянной и составляла 0,1 сек, диаметр пятна в фокальной плоскости был равен 100 μm, мощность – 350 мВт. Наносили по 10 коагулятов рядом с диском зрительного нерва (ДЗН) [3][4].

Модель № 3 неоваскуляризации передней (роговичной) локализации формировали путем нанесения 40-секундной аппликации на апекс роговицы диском хлопчатобумажной ткани диаметром 7 мм, пропитанным 10% раствором NаОН [5].

Модель № 4 формировали путем прошивания роговицы кролика викриловыми швами (15 кроликов). Известно, что викриловые нити 6–0, 7–0 вызывают воспалительную реакцию, в которой действуют провоспалительные и проангиогенные индукторы неоангиогенеза. Патологический процесс завершался формированием фиброваскулярного комплекса с образованием сосудов в строме роговицы [6–9].

Оперированные глаза обрабатывали дезинфицирующим раствором с последующими инстилляциями антибиотиков в течение 7 дней.

При работе с экспериментальными животными придерживались международных стандартов (Резолюция ARVO «По использованию животных в экспериментальных исследованиях» 2018 г.).

Ежедневно в течение 14 дней экспериментальным животным с моделями неоангиогенеза передней и задней локализации проводили биомикроскопию/офтальмоскопию.

Картину глазного дна фотографировали на фундус-камере. Наряду с фоторегистрацией клинической картины неоангиогенеза выполняли ангиографию переднего или заднего отрезка глаза с флюоресцеином (ФАГ), морфологические исследования в полном объеме. Таким образом, формирование хориоретинальной неоваскуляризации (ХНВ) подтверждали офтальмоскопически и ангиографически, вводя в ушную вену флюоресцеин натрия.

Мониторинг и оценку состояния глаз кроликов (до, в ходе опыта и в процессе динамического наблюдения) осуществляли, используя следующие средства и методы визуализации: бинокулярный (налобный) офтальмоскоп непрямого вида Heine, фундус-камеру VISUCAM 500 ZEISS (цветное фотографирование), ручную фундус-камеру Portable Ophthalmic Imager Volk Optical, Inc., которую применяли для фоторегистрации глазного дна в зоне интереса на операционном столе в условиях операционной, фундус-камеру FF 450 ZEISS (ФАГ), сканирующий лазерный офтальмоскоп F-10 Nidek (ФАГ, аутофлюоресценция (AF)).

Все четыре экспериментальные модели продемонстрировали клинические признаки неоваскуляризации с различными клиническими проявлениями, верифицированные ангиографически, морфометрически (модели № 1 и 2 по данным ОКТ, in vivo) и гистологически (модели № 1–4, ex vivo). При этом не все модели одинаково успешно реализовывались и приводили к клинике ожидаемого заболевания (см. табл. 1). Процент «выхода» СНМ на моделях № 1, 2, 3, 4 составил 100, 75, 80, 100% соответственно.

Модель № 1. Под воздействием имплантированного в супрахориоидею матригеля с VEGF165 активизировалась пролиферация эндотелиальных клеток хориокапилляров, последние дилатировались – и появлялись аномально крупные хориоидальные сосуды, зрительно напоминающие полипоидальные. Офтальмоскопически на глазном дне просматривались сосудистые выпячивания, которые ограничивались субретинальной локализацией, вероятнее всего из-за барьерной роли интактной мембраны Бруха и сохранного ретинального эпителия, однако в рамках ограниченного пространства сосуды хориоидеи приобретали аномально крупные размеры и конфигурацию. Через 7 дней после введения матригеля с 500 нг/мл VEGF165 на глазном дне в месте, соответствующем зоне введения комплекса матригеля со стороны склеры, просматривались слабо проминирующие в стекловидное тело участки «ретино-хориоидальных сосудоподобных» стволов явно аномальных размеров. По их ходу были отчетливо видны паравазальные гиперпигментированные линии «сопровождения». На 7-й день была проведена ФАГ и регистрация AF, после чего выполнена деструкция мембраны Бруха. К 21-му дню формировалась СНМ, которую также верифицировали с помощью ангиографии и гистологии (рис. 1 а–г).

Модель № 2. На глазном дне в течение первых трех дней в месте коагуляции сохранялся фокальный отек сетчатки, по краям коагулятов местами возникали точечные петехиальные кровоизлияния. В следующие 2 недели развивалась неоваскуляризация, впоследствии переходящая в хориоретинальный рубец с отложением в нем пигмента. У некоторых животных (9 глаз) на месте коагулятов начиная с 6-х суток после лазеркоагуляции образовывалась локальная отслойка ретинального пигментного эпителия (РПЭ) с последующим формированием фиброваскулярного комплекса (рис. 2 а–е).

Модель № 3. На глазах кроликов после нанесения щелочного ожога с 7-е по 14-е сутки отмечалась воспалительная реакция в роговице с формированием эрозий (11 глаз), переходящих в язву (5 глаз) или эктазии с последующим формированием бельма и развитием роговичной интрастромальной неоваскуляризации в 80% опытных глаз. Стадия неоангиогенеза длилась более 60 суток (рис. 3 а–д).

Модель № 4. В роговице кроличьих глаз по ходу викриловых швов развивалось воспаление с выраженным отеком роговицы. В сроки наблюдения до трех недель после наложения роговичных швов на всех глазах биомикроскопически наблюдали интенсивный рост новообразованных сосудов роговицы с лимба. Через 3 недели в месте наложения швов определялась разветвленная неоваскулярная сеть, состоявшая из поверхностно и глубоко расположенных в строме роговицы новообразованных сосудов (рис. 4 а, б). В экспериментальной офтальмологии часто приходится использовать различные модели неоангиогенеза на глазах экспериментальных животных.

Безусловно, модели ХНВ ближе по клиническим проявлениям и механизмам патогенеза природным проявлениям неоваскулярной формы возрастной макулярной дегенерации (н-ВМД). Однако на них сложнее протестировать лекарственные технологии, проанализировать спектр их биологических эффектов, а также выполнить сравнительную оценку эффективности с уже известными препаратами-аналогами. В этом аспекте модели передней локализации предпочтительнее из-за свободного доступа, легкости воспроизведения и хорошей визуализации зоны интереса, позволяющей выполнять мониторинг в ходе лечения. Вместе с тем ангиогенез на этих моделях имеет другую природу и отчасти другие механизмы, в которых большую роль играют воспалительные реакции. Однако эти модели позволяют провести комплексное исследование патологического процесса с количественным подсчетом новообразованных сосудов в роговице, включая их длину, диаметр просвета, и оценить полноценность анатомии сосудистой стенки, состав и плотность паравазального клеточного микроокружения.

Экспериментальные модели заболеваний глаз на животных занимают важное место в медицинских доклинических исследованиях. Они необходимы для разработки новых терапевтических стратегий лечения заболеваний глаз у людей. Кроме того, использование моделей неоваскулярных заболеваний глаз – путь к пониманию патофизиологии заболеваний и выбору конкретных протоколов лечения этих заболеваний. В настоящее время доступен ряд моделей на животных для различных заболеваний сосудистой оболочки и сетчатки [9–22]. Исследователь должен сделать правильный выбор адекватной модели, имеющей наибольшую гомологию с анатомией и патологией человека, на начальном этапе своих исследований [13–23], а кроме того, осуществить выбор экспериментального животного для этой модели [9–12]. Так, традиционно модель СНМ формировали у приматов и грызунов, а преретинальная неоваскуляризация лучше воспроизводилась у кроликов. СНМ формировали путем воздействия лазерного излучения (зеленый, размер пятна 100 мкм, мощность 180–300 мВт, продолжительность 0,1 секунды; или 810 нм, размер пятна 100 мкм, мощность 150–180 мВт, экспозиция 0,1 секунды). У разных животных есть области глазного дна, «хорошо» реагирующие на лазерное воздействие. Например, у приматов это 8 областей между основными кровеносными сосудами в положениях 3, 6, 9 и 12 часов на два диаметра диска эксцентрично от ДЗН. Для воспроизведения СНМ достаточно нанести 4 коагулята на глазном дне. Появление в ходе эксперимента испарений, кавитационных пузырьков подтвердит факт разрыва мембраны Бруха [9–12]. У нечеловеческих приматов размер пятна следует уменьшать до 50 мм, а продолжительность воздействия – до 100 мс [17–19]. Хотя мощность воздействия может варьироваться в диапазоне от 240 до 1500 мВт, чаще всего используется мощность 300–700 мВт. Недавние исследования показали, что CНМ лучше формируется после нанесения коагулятов в макуле [21–22]. Физиология и анатомия глаз человеческих и нечеловеческих приматов похожи. Таким образом, для доклинической оценки вариантов лечения н-ВМД предпочтительнее модели СНМ, индуцированные лазером у приматов – макак-резусов и яванских макак [17–24]. Исключение составляет модель СНМ, сформированной у трансгенных мышей за счет повышенной экспрессии фактора роста эндотелия сосудов в сетчатке [25]. Однако содержание приматов финансово затратно, а продолжительность экспериментов затягивается на месяцы.

Многие исследователи пытались вызвать неоваскуляризацию сетчатки в эксперименте путем интравитреальной инъекции дермальных фибробластов, интравитреальных имплантов, импрегнированных интерлейкином-1, путем лазерной фотокоагуляции вен сетчатки и гипероксигенации, имплантации интравитреальных опухолевых клеток и интравитреального введения культивированных фибробластов. В качестве экспериментального вида животного во многих работах исследователи брали грызунов и кроликов [26–36]. У мелких животных патологические процессы развивались быстрее, продолжительность мониторинга укорачивалась, их себестоимость и содержание в виварии удешевлялись. Такие исследования расширяли наши знания о механизмах индукции, роли отдельных патогенетических звеньев и молекулярных участников.

В преддверии клинических испытаний доклинические этапы с использованием нескольких моделей заболевания и нескольких видов экспериментальных животных были оправданы и целесообразны. Именно такой подход был одобрен последними российскими регламентирующими документами (Приказ Минздравсоцразвития России от 01.04.2016 № 199 н «Об утверждении правил лабораторной практики», Национальный стандарт Российской Федерации (ГОСТ 33044–2014 от 26.01.2015)) [37–38].

На этапе доклинических исследований мы изучали ангиостатический потенциал трех рекомбинантных пептидов, формируя 4 модели хориоретинальной неоваскуляризации с разными механизмами индукции и разными клиническими фенотипами СНМ.

Таким образом, нами была проанализирована пригодность четырех различных моделей неоангиогенеза (хориоретинальной и роговичной) для тестирования препаратов с заявленным ангиостатическим потенциалом. Для получения полноценного объема информации об испытуемом препарате с заявленным ангиостатическим потенциалом необходимо использовать несколько моделей неоангиогенеза с разными механизмами патогенеза, на которых можно изучить спектр их возможностей и побочных эффектов, а также оценить весь спектр биологических эффектов.

Вклад авторов: авторы внесли равный вклад в эту работу.

Концепция и дизайн исследования, обзор литературы, анализ и интерпретация данных, анализ изображений, написание статьи, финальное редактирование: В. Г. Лихванцева (33,3%), А. С. Геворкян (33,3%) и С. Г. Капкова (33,3%).

Authors’ contributions: authors have contributed equally to this work.

Literature review, data analysis and interpretation, imaging analysis, manuscript editing, final editing: V.G. Likhvantseva (33%), A.S. Gevorgyan (33%), S.G. Kapkova (33%).